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pH에 민감한 TAT-Au NP-Dox 접합체의 합성 및 약물 방출 역학

TAT-Au NP가 BBB를 효율적으로 통과하여 종양 부위에 축적될 수 있음을 입증한 후, 다음으로 두개내 신경교종에 치료제를 전달하는 데 이를 사용하는 방법을 고려했습니다. 이를 위해 독소루비신(Dox)을 모델 의약품으로 선택했습니다. Dox는 그 자체로 BBB를 관통할 수 없는 DNA 삽입제이지만, 신경교종 세포로 배양할 때 강력한 세포독성을 가지고 있는 것으로 나타났습니다.^[25] 우리는 암세포의 빠른 대사 속도를 통한 젖산의 과잉 생산으로 인한 산성 종양 미세환경이 촉발되고 제어된 약물 방출을 허용한다는 가설을 세우고 산성 불안정성 히드라존 링커를 통해 Dox를 Au NP에 접합하기로 결정했습니다.^[26] 또한 엔도솜 및 리소좀과 같은 세포 내 구획은 산성 환경(pH = 4.5-6.0)으로 인해 접합체에서 Dox 방출을 유발할 수도 있습니다.^[27]

히드라존 결합을 생성하기 위해, Au NP 전구체를 메틸 티오글리콜레이트, HS-PEG-OCH로 변형시켰다₃, HS-PEG-COOH 및 히드라진(그림 2a). Dox의 케톤기는 히드라진-변형된 Au NP에 접합되었다.^[28] 접합체는 평균 코어 크기가 5nm인 수용액에 잘 분산되어 있었습니다(그림 S2a). Au NP당 Dox 분자의 수는 Dox의 흡광 계수(1.15 ×10⁴ M^-1 센티미터^-1) 및 Au NP(1.5 ×10⁷ M^-1 센티미터^-1) (그림 S2b).^[29,30년] 평균적으로, 각 Au NP는 NP의 침전을 일으키지 않고 ∼150 Dox 분자와 접합되었습니다. Au NP에 Dox의 존재는 다음을 통해 추가로 확인되었습니다. ^[1]3.9, 4.5, 4.8, 4.9, 5.2, 5.4, 7.6 및 7.9ppm에서 Dox의 특징적인 공명을 나타낸 H NMR 스펙트럼(그림 S2c). TAT-Au NP와 비교하여, TAT-Au NP-Dox는 Dox에서 유리 아민의 양성자화로 인해 겔 전기영동에서 음극 쪽으로 더 많은 띠 이동을 보여주었습니다(그림 S2d). Au NP에 대한 TAT 펩타이드와 Dox의 접합은 515nm에서 FITC의 형광으로 식별된 FITC 표지 TAT 펩타이드의 접합 및 형광 스펙트럼에서 590nm에서 Dox의 특징적인 흡광도에 의해 추가로 확인되었습니다. (그림 S2e 및 S2f). UV-Vis 분광법에 의한 TAT-Au NP-Dox 접합체의 Dox에 대한 시험관 내 방출 연구는 Au NP의 약물 방출이 pH 및 시간에 따라 달라진다는 것을 확인했습니다. pH 7.4에서 접합체는 안정적이었고 따라서 전신 수송이 가능했습니다. pH 4.7에서 Dox의 90% 이상이 6시간 이내에 Au NP에서 방출되었습니다(그림 2b).

그림 2

pH 민감성 TAT-Au NP-Dox 접합체는 신경교종 세포에 대한 향상된 세포독성을 유도합니다.

(a) TAT-Au NP-Dox 접합체는 산성 조건에서 자유 Dox를 방출합니다. (b) pH 7.4 및 4.7에서 시간 의존적 약물 방출. (c) Dox 형광을 모니터링하여 각각 유리 Dox, Au NP-Dox 및 TAT-Au NP-Dox로 처리된 U87 세포의 약물 흡수 정량화. (d) 각각 0.5μM의 Dox 농도에서 TAT-Au NP, Dox, Au NP-Dox 및 TAT-Au NP-Dox 접합체로 처리된 신경교종 세포의 광학 현미경 이미지. (e) 각각 U87, U251 및 GBM 43 인간 신경교종 세포주에 대한 Dox, Au NP-Dox 및 TAT-Au NP-Dox 접합체에 의한 세포 독성의 MTT 정량화.

신경교종 치료를 위한 TAT-Au NP-Dox의 시험관 내 치료 효과 향상

TAT-Au NP-Dox 접합체의 세포 내 흡수를 조사하기 위해 유세포 분석을 사용하여 in vitro에서 접합체를 흡수한 신경교종 세포의 비율을 평가했습니다. 접합체로 24시간 배양 후, U87 신경교종 세포의 100%가 Dox의 흡수를 보여주었습니다(그림 S3). TAT-Au NP-Dox 처리된 세포의 평균 Dox 형광 강도가 유리 Dox 또는 Au NP-Dox로 처리된 세포와 비교했을 때 2배 증가한 것이 관찰되었습니다(그림 2c). 공유 결합이 세포독성에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 동일한 양의 TAT-Au NP, Dox, Au NP-Dox 및 TAT-Au NP-Dox로 U87 신경교종 세포를 배양한 결과, TAT-Au NP-Dox를 사용한 배양이 세포 형태에 기초하여 free Dox 및 Au NP-Dox보다 향상된 세포독성을 유도한다는 것을 확인했습니다(그림 2d). TAT-Au NP-Dox의 세포독성은 4시간 배양 후 명백해졌으며 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 S4). The IC₅₀ TAT-Au의 NP-Dox(56nM)는 U87 세포주(그림 2e). TAT-Au NP-Dox를 사용한 유사한 향상된 세포독성은 다른 인간 신경교종 세포주에서도 관찰되었습니다. free Dox와 비교했을 때, IC는 각각 14배와 3.5배 감소했습니다₅₀ 각각 U251 및 GBM43 세포주에서 관찰되었다(그림 2e). free Dox와 유사하게, TAT-Au NP-Dox 처리된 세포는 세포사멸의 핵심 마커인 절단된 capase-3에 대해서도 양성이었으며(그림 S5), 이는 TAT-Au NP-Dox가 암세포를 죽이기 위해 free Dox를 방출할 수 있음을 시사합니다.

시험관 내 연구에서 TAT-Au NP는 안정적이고 생체 적합성이 입증되었습니다. 이러한 입자로 72시간 동안 연속적으로 배양한 U87 세포는 세포 형태(그림 2d) 및 이들 처리된 세포의 생존력을 조사하는 정량적 연구는 MTT 분석에 의해 평가된 바와 같이 처리되지 않은 그룹과 유사하였다(도 1. S6). TAT 펩타이드는 일반적으로 세포독성이 있는 것으로 알려져 있지만, 본 연구의 결과는 TAT 펩타이드의 독성 특성이 Au NP에 부착되면 세포 매개 손상을 방지하는 방식으로 극적으로 변화한다는 것을 보여주었습니다.

약물 방출 경로를 조사하기 위해 Dox의 세포 내 국소화를 컨포칼 현미경으로 모니터링했습니다. 에서 볼 수 있듯이 그림 3a, TAT-Au NP-Dox 접합체는 U87 세포에 의해 효율적으로 흡수되었으며, 산성 환경이 Dox 방출을 촉발했을 가능성이 있는 4시간 이내에 주로 리소좀에 국한되었습니다. DNA intercalator 및 topoisomerase II의 억제제로서 Dox 세포 독성의 주요 메커니즘과 일치하며,^[31] 우리는 TAT-Au NP-Dox(그림 3b). TEM에 의해 관찰된 Au NP의 세포 내 분포는 세포 리소좀 내에서 Au NP 국소화를 보여주었으며, 그 중 일부는 핵 주위 영역(그림 3c 및 3d). 또한, TAT-Au NP-Dox 접합체가 세포막에 결합하는 것도 관찰되었는데, 이는 TAT 펩타이드와 지질 이중층(그림 3c). 이전 연구에 따르면 TAT-Au NP는 암세포의 막 장벽과 상호 작용하여 세포 소포에 의해 흡수될 수 있으며, 이 소포체는 TAT 펩타이드 변형 나노입자의 거동과 일치하는 수송 경로의 일부로 리소좀과 융합됩니다.^[11,13년] 대조적으로, 핵 내부에서는 Au NP가 발견되지 않았습니다 (Fig. 3d), 관찰된 세포독성은 TAT-Au NP에서 방출된 Dox의 작용에 의한 것이지 플랫폼 자체에 의한 것이 아님을 추가로 확인했습니다. 또한, TAT-Au NP-Dox 접합체는 TEM에 의한 Nm-Au NP-Dox 접합체와 비교했을 때 향상된 수준의 세포 흡수를 보였으며, 이는 TAT 펩타이드가 세포 침투를 개선했음을 시사합니다(그림 S7). 종합하면, 본 연구의 결과는 전체 수송 경로에 TAT-Au-Dox 접합체의 세포 흡수, 리소좀 내 free Dox의 방출, free Dox의 핵 전위가 포함된다는 것을 강력하게 시사합니다.

그림 3

신경교종 세포 리소좀 및 세포핵에서 Au-NP 매개 Dox 방출의 시험관 내 연구

(a) 컨포칼 현미경으로 평가한 배양 4시간 후 리소좀에서 Dox의 공동 국소화. (b) 24시간에 세포핵에서 독스 축적이 관찰되었다. (c) TAT-Au NP-Dox로 24시간 배양 후 신경교종 세포의 TEM 이미지는 Au NP가 세포막 주변과 세포 리소좀 내에 분포되어 있음을 보여주었습니다. (d) Au NP는 핵 주위 영역에 국한되었지만 핵에 들어갈 수 없었습니다. 빨간색 화살표는 Au NP를 나타냅니다.

두개내 U87 마우스 모델에서 TAT-Au NP-Dox의 치료 효능

TAT-Au NP가 BBB를 효율적으로 통과할 수 있고 TAT-Au NP-Dox 접합체가 신경교종 세포에 대한 향상된 세포독성을 나타낸다는 고무적인 발견과 함께, 다음으로 TAT-Au NP-Dox 접합체가 BBB를 통과하여 I.V. 투여 후 Dox를 정형외과 U87 신경교종 마우스 모델에 전달할 수 있는지 여부를 다루었습니다(그림 4). Dox가 뇌 실질에서 제외되었다는 보고와 일치하게,^[25] 컨포칼 현미경 검사는 Dox 자체가 처음 24시간 이내에 종양 조직에 축적될 수 없음을 보여주었습니다(그림 4a). 대조적으로, 동일한 몰 용량의 TAT-Au NP-Dox 주사는 뇌종양 조직 내에서 명백한 Dox 축적을 보여주었습니다(그림 4a). 이 관찰과 일치하게, Au NP의 유사한 축적 패턴이 은 강화 염색을 사용하여 인접한 뇌 절편에서 관찰되었습니다 (그림 4b). ICP-MS(그램당 4.5±1.1μg)에 의해 뇌 조직에서 정량화된 금 함량(그림 4c)는 TAT-Au NP-Dox 접합체가 BBB를 관통하여 종양 조직에 도달한 것을 추가로 확인하였다. 또한, 소변 샘플의 금 함량은 그램당 2.6±0.21μg(그림 4c), Au NP가 신장 청소를 받을 수 있을 만큼 충분히 작았음을 시사합니다. 우리는 또한 접합체가 혈액에서 Au NP의 순환이 상대적으로 길다는 것을 발견했습니다. 8.1±0.34% Au NP의 ID는 주사 후 24시간 후 혈액에서 발견되었습니다(그림 4d).

그림 4

두개내 U87 신경교종 마우스 모델에서 pH에 민감한 TAT-Au NP-Dox 전달 시스템의 치료 효능

(a) I.V. 주입 24시간 후 마우스 뇌 조직의 컨포칼 이미지는 TAT-Au-NP 투여 후 마우스에서 Dox 축적을 보여주었습니다. 약물을 단독으로 투여했을 때 Dox 축적이 관찰되지 않았다 (b) 뇌종양 조직에서 TAT-Au NP의 국소화를 확인하는 H&E 및 은 강화에 의해 염색된 TAT-Au NP-Dox 주입 마우스의 뇌 조직. (c) TAT-Au NP-Dox 처리 마우스(n=5)의 뇌 및 소변 샘플의 금 함량 정량화. (d) TAT-Au NP-Dox 주입 마우스의 혈액 샘플에서 금의 정량화. (e) 1.5mg/kg의 Dox 농도에서 생리식염수(n=5), Dox(n=6), Au NP-Dox(n=4) 및 (f) TAT-Au NP-Dox(n=6)를 주입한 두개내 U87 신경교종 종양 보유 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선. (f) 주입 6주 후 TAT-Au NP-Dox 처리된 마우스에서 H&E 및 은 강화 염색이 있는 조직 샘플의 조직학 이미지.

다음으로 1회 투여 I.V. 주사를 통한 TAT-Au NP-Dox 투여가 신경교종 보유 마우스(그림 4e). U87 신경교종 보유 마우스를 4개 그룹으로 나누어 TAT-Au NP-Dox, Au NP-Dox, Dox 및 생리식염수를 각각 1.5mg/kg의 단일 용량으로 주사했습니다. Dox를 처리한 마우스(37.5일)와 Au NP-Dox를 처리한 마우스(37일)의 전체 생존기간 중앙값은 식염수를 처리한 그룹(34일)에 비해 미미한 이점만을 보였다(그림 4e). 대조적으로, TAT-Au NP-Dox를 처리한 마우스(44일)의 생존기간 중앙값은 식염수(p<0.01) 또는 Dox를 처리한 마우스(p<0.05)보다 유의하게 길었다(그림 4e). 중요한 것은 IV로 투여된 TAT-Au NP가 유의한 전신 독성을 나타내지 않았다는 것입니다. TAT-Au NP를 주입한 정상 마우스(n=4)는 10개월 이상 생존했으며(도 S8), 또한 TAT-Au NP-Dox 처리된 마우스에 대한 종양 이식 후 30일 이상 동물의 조기 폐사 및 체중 감소가 관찰되지 않았다(도 S9). TAT-Au NP-Dox 접합체가 질병이 없는 장기에 해를 끼칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해 TAT-Au NP-Dox 주사 6주 후 뇌, 비장, 간, 심장, 폐, 방광 및 신장 장기에서 세포 형태 및 Au NP의 축적을 분석했습니다(그림 4f)을 통해 TAT-Au NP-Dox의 처리가 식염수 처리된 마우스와 비교했을 때 어떠한 형태학적 변화도 일으키지 않았음을 발견했으며(도 S10), Au NP가 이들 기관에 독성이 없음을 시사하였다. 게다가, Au NP는 주사 후 6주 동안 정상 뇌 또는 종양 부위에서 발견되지 않았으며, 이는 NP가 뇌에서 완전히 제거되었음을 시사합니다. 다른 NP 보인자와 유사하게, Au NP는 다른 장기보다 비장과 간에 더 많이 축적되는 것으로 나타났으며, 이는 그들의 청소가 망상내피계를 통해 이루어졌음을 시사합니다. 흥미롭게도, Dox의 주요 부작용은 심장 독성이며,^[32] 그러나 심장에서 Au NP의 축적은 무시할 수 있을 정도로 미미한 수준만 관찰되었으며, TAT-Au NP-Dox 투여 후 심근 조직의 변화는 거의 관찰되지 않았으며, 이는 당사의 전달 시스템이 Dox로 인한 심장 독성을 극복하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 또한, Au NP가 신장의 사구체와 방광의 기질에 국한되어 있으며, 이는 신장 배설이 소변 샘플에서 발견되는 Au NP의 양과 일치하는 Au NP의 주요 청소 경로일 수 있음을 시사합니다.

Cell culture and animals

Glioma cell lines, U87, U251, GBM43 and GL261 were cultured in DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA), containing 2% penicillin and streptomycin antibiotic (Cellgro, Mediatech, Inc., Manassas, VA, USA) and 10% fetal bovine serum (FBS; Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA). 6-8 week-old male athymic nude mice were purchased from Charles River Laboratory (Wilmington, MA, USA) and C57BL/6 mice were obtained from Jackson Laboratories. Brain tumor bearing mice were established by intracranially injecting glioma cells into the right hemisphere of the brain. A burr hole centered 2 mm lateral to the sagittal suture and 2 mm posterior to the coronal suture was drilled into the right side of the skull. After positioning the animals in a stereotactic frame, 4×10⁵ glioma cells in 2.5 μL PBS were injected at a depth of approximately 3 mm into the brain. Animals were cared for according to an animal protocol approved by Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Chicago.

Synthesis of TAT-Au NPs and Nm-Au NPs

Dodecylamine coated Au NPs were synthesized based on the reduction of HAuCl₄ by NaBH₄ in toluene.^[48] To synthesize TAT-Au NPs, Au NPs in chloroform (4×10^-8 mol) were treated with a mixture of biofunctional HOOC-PEG-SH (MW 1000 Daltons, 8×10^-6 mol) and monofunctional CH₃O-PEG-SH (MW 2000 Daltons, 3.2×10^-5 mol) for 24 hours. After purification by centrifugation, the -COOH on the Au NPs was activated by EDC and sulfo-NHS for 15 minutes in MES buffer and coupled with the -NH₂ groups on the TAT peptide. The Nm-Au NP was synthesized by treatment of Au NPs with CH₃O-PEG-SH (MW 2000 Daltons) and purified by centrifugation.

Synthesis of pH sensitive TAT-Au NP-Dox conjugates

To synthesize TAT-Au NP-Dox, methyl thioglycolate (2.4×10^-5 mol), biofunctional HOOC-PEG-SH (1.12×10^-5 mol) and monofunctional PEG-SH (4.48×10^-5 mol) were mixed with Au NPs (4×10^-8 mol) in chloroform for 24 hours to achieve functionality and stability in aqueous solution. After purification, 400 μL of 10% hydrazine solution was added to the above Au NP solution and the mixture was incubated overnight at room temperature. The hydrazine modified Au NPs were then incubated with Dox (2.4×10^-5 mol) for 24 hours. The -COOH on the Au NPs was activated by 0.6 mg of EDC and 1 mg of sulfo-NHS to conjugate with the -NH₂ groups on the TAT peptide. Similarly, Au NP-Dox with the same drug loading was synthesized. Each step of the synthesis was monitored by transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), gel electrophoresis, and UV-Vis spectrometry. The final Dox and TAT peptide concentration in the TAT-Au NP-Dox solution were determined by UV-Vis and fluorescence spectrometry.

Synthesis of TAT-Au NP-Gd conjugates

To synthesize the conjugates, pNH₂-Bn-DTPA (99.5 mg, 0.1 mmol) was added to a flask (50 mL) containing PBS buffer (5.2 mL, 40 mM, pH 7.4) to give a clear solution. Then SPDP (31.2 mg, 0.1 mmol) in anhydrous DMF (5.2 mL) was added dropwisely and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The solvents were removed by evaporation in high vacuum and the residue was dissolved in deionized water. The DTPA-SS was purified by C18 RP HPLC eluting with 0-50% acetonitrile in TEAA (0.1 M, pH 7.0). The Maldi-TOF MS of the product gave the expected peaks at [MH] = 696 and [MNa] = 718. DTPA-SS (2.25×10^++-6 mol) was reacted with 8.6 ×10^-6 mol TECP in water for 5 minutes to break the disulfide bond to generate DTPA-SH. TAT-Au NPs (1.5 ×10^-8 mol) were added to the above mixture and stirred for 24 hours. The TAT-Au NP-DTPA conjugates were purified by centrifugation and dissolved in water, which was then treated with GdCl₃ (1.125×10^-5 mol) for 24 hours. The final TAT-Au NP-Gd conjugates were obtained and washed using the centrifugation tubes with 10,000 Da membrane until no free Gd³⁺ was detected by xylenol orange diodium. The conjugates were characterized by UV-Vis spectrometry, DLS and TEM. The Gd³⁺ ion per Au NP and cellular uptake were quantified using inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy (ICP-OES).

In vitro Dox release experiments

In vitro Dox release experiments were performed using PBS buffer (pH = 7.4,) and 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffered saline (pH = 4.7), respectively. For each release study, TAT-Au NP-Dox solution was incubated with 0.5 mL buffer solution at room temperature. Release media was taken out for analysis at specific time intervals by centrifuging at 13,000 rpm for 20 minutes. The released percentage of the Dox molecules in the supernatant was determined by UV-Vis spectrometry.

Flow cytometric assessment of TAT-Au NP-Dox treated glioma cells

2×10⁵ U87 신경교종 세포를 각각 1μM Dox에서 TAT-Au NP-Dox, Au NP-Dox 및 Dox로 24시간 및 48시간 동안 배양했습니다. 이어서, 세포를 10% FBS DMEM으로 3회 세척하고, BD 고정 완충액에 고정하였다. 세포를 200μL FACS 완충액(1% BSA 및 0.01% NaN₃). 488 nm Sapphire Laser를 사용한 BD Biosciences FACSCanto 유세포 분석기를 사용하여 PE-A 채널을 통해 세포 내 Dox 형광을 검출했습니다. 각 조건에 대해 10,000개의 이벤트를 수집하고 분석했습니다. 세포사멸 정량을 위해, 절단된 카스파제-3(Asp175) 항체(Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA)를 세포 현탁액에 첨가하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 1:500 희석된 항-토끼 Alexa Fluor 647 접합 2차 항체를 암흑 상태에서 한 시간 더 처리하였다. 자가사멸 세포는 APC-A 채널을 통해 검출되었습니다.^®

MTT 분석을 통한 TAT-Au NP-Dox 세포독성 평가

신경교종 세포는 1×10에 96개의 웰 플레이트에 파종되었습니다⁴ 웰당 세포 및 37°C 및 5% CO에서 TAT-Au NP-Dox, Au NP-Dox, Dox 및 TAT-Au NP로 배양처리₂ 각각 48시간 동안. MTT 라벨링 시약 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Cell Proliferation Kit I(MTT), Roche Applied Sciences, Indianapolis)를 웰에 첨가하고 제조업체의 프로토콜에 따라 4시간 동안 배양하였다. 100μL의 10% SDS 가용화 용액을 웰에 첨가하여 보라색 포르마잔 염 결정을 용해시켰습니다. 플레이트는 GeneMate 마이크로플레이트 리더에서 판독되었습니다. 각 조건에 대해 4-6회의 반복실험을 포함하고 실험을 2회 반복했습니다.

컨포칼 현미경에 의한 TAT-Au NP-Dox 흡수 측정

5×10⁴ U87 신경교종 세포를 유리 바닥 배양 접시에 파종했습니다. 10% FBS DMEM의 TAT-Au NP-Dox, Au NP-Dox 및 Dox를 각각 1μM의 Dox 농도에서 접시에 첨가하였다. 처리된 세포는 공초점 현미경을 통해 배양 후 4시간 및 24시간에 모니터링되었습니다. 세포 내 리소좀의 위치를 결정하기 위해 처리된 세포를 PBS로 3회 세척하고 7.5×10에서 LysoTracker Green DND-26(Invitrogen, USA)으로 배양했습니다^-8 M을 30분 동안 누릅니다. 살아있는 세포 이미지는 Leica SP5 II STED-CW 초고해상도 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 촬영했습니다.

TEM에 의한 신경교종 세포의 Au NP 국소화 측정

1×10⁶ U87 신경교종 세포를 배양 접시에 파종했습니다. 세포를 각각 2μM의 Au NP 농도에서 TAT-Au NP-Dox 및 Au NP-Dox로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 무혈청 DMEM으로 2회 헹구고 2시간 동안 글루타르알데히드에 고정시켰다. 세포 펠릿을 세척하고 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액에 1% 오스뮴테트로옥사이드로 1시간 동안 고정시켰다. 펠릿을 소듐 카코딜레이트 완충액으로 세척하고, 염색을 위해 1% 우라닐 아세테이트를 첨가하였다. 에탄올 농도를 증가시킨 일련의 세척으로 탈수한 후, 프로필렌 옥사이드(PO)를 2:1 PO : 스퍼 수지, 1 : 1 PO : 스퍼 수지 및 100% 스퍼 수지로 첨가하였다. 샘플을 60°C에서 밤새 유지했습니다. 수지 블록을 ∼100nm 두께의 초박편절기로 절단하여 구리 TEM 그리드로 옮겼습니다. 이미지는 고성능 CCD 카메라가 장착된 FEI Tecnai F30 주사 투과 전자 현미경으로 촬영되었습니다.

조직에 대한 Au NP의 생체 분포

조직학 연구를 위해, 마우스의 뇌, 비장, 간, 심장, 폐, 신장 및 방광을 Tissue-Tek® O.C.T. 화합물에서 신선하게 동결하고 10μm 두께로 절편하였다. 조직 슬라이드는 뇌의 구조적 형태학 연구를 위해 NP와 헤마톡실린 및 에오신(H&E)을 시각화하기 위해 은으로 강화된 염색으로 공동 염색되었습니다. 정량화를 위해 마우스의 뇌를 농축 질산으로 분해하고 금 함량을 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 정량화했습니다.

MRI 실험

모든 MRI 실험은 내경이 11.6cm인 30cm 수평 보어 Bruker BioSpec 9.4 Tesla 소동물 MR 시스템(Bruker-Biospin, Billerica, MA)에서 수행되었습니다(모든 축에 대해 최대 일정한 기울기 강도: 230mT, m⁻¹) 및 볼륨 쿼드 코일(Bruker BioSpin MRI GmbH 쿼드 코일, OD/ID = 59/35mm, 길이 = 38mm)을 포함할 수 있습니다. 신경교종 보유 마우스는 수술 마취면을 유지하기 위해 1.5-2% 이소플루란을 의료용 공기와 혼합하여 시술 중에 마취시켰다. 온도는 온도계로 지속적으로 모니터링되고 따뜻한 공기로 제어되었습니다. 심박수, 호흡수 및 혈압은 MRI에 사용하기 위해 개발된 SA Instruments(Stony Brook, NY)의 광학 감지 시스템으로 모니터링되었습니다. 동물 실험의 경우, 먼저 코로나 및 축 방향 모두에서 다중 슬라이스 RARE(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) 시퀀스(반복 시간(TR)/에코 시간(TE_효과적인) = 4000/20.4msec, 어레이 크기 = 256×256, 시야 = 25.6mm × 25.6mm, 슬라이스 두께 = 0.5mm, 희귀 계수 = 4, NEX(여기 수) = 2). 팬텀 실험의 경우 슬라이스 두께는 1mm였습니다. 그런 다음, T₁-가중 이미징 및 T₁ 측정은 T를 기준으로 선택된 슬라이스에 대해 수행되었습니다.₂-가중 이미징. 그래디언트 에코(빠른 로우 앵글 샷 시퀀스)의 경우 TR/TE = 700/5msec, 플립 각도 = 30°, 슬라이스 두께 = 1mm 매개변수가 사용되었습니다. 다른 모든 매개 변수는 스핀 에코 시퀀스와 같습니다. T의 경우₁ 측정, 스핀-격자 이완(T₁) 시간은 다음 파라미터를 사용한 포화 회복 시퀀스의 획득을 기반으로 결정되었습니다: TR = 14.1, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000, 10,000 및 15,000msec, TE = 10msec, 어레이 크기 = 128×128, 슬라이스 두께 = 1 – 3mm, NEX = 1. 데이터는 IDL(Exelis VIS, Inc., Boulder, CO)로 작성된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 처리 및 분석되었습니다.

이 연구는 미국 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke U01NS069997)의 지원을 받아 MSL로, K01 HG006699에서 QD, F32NS073366 및 K99NS082381에서 DAW로 R01NS077388합니다. TEM 이미지 분석에 도움을 주신 시카고 대학교 전자 현미경 핵심 시설의 Yimei Chen과 Case Western Reserve University의 Hisashi Fujioka 박사에게 감사드립니다. 기술 지원을 해주신 시카고 대학의 MRI 핵심 시설에 감사드립니다.